铁载体产生菌Paenibacillus illinoisensisYZ29在花生根际定殖能力研究

用绿色荧光蛋白(GFP)标记靶微生物是研究微生物与宿主相互作用的重要手段。本研究采用电击转化法将穿梭载体pgp4412转化为伊氏杆菌YZ29,成功获得表达gf p的YZ29 gfp菌株。采用双抗体平板筛选和荧光显微镜观察了YZ29铁载体产生菌在花生根系和土壤中的定植情况。结果表明,在488nm激发波长的蓝光下可观察到绿色荧光;YZ29-GFP在盆栽条件下可在花生根际土壤和非根际土壤中定植;在实验室培养条件下,YZ29-GFP在花生根面上定植,但不在根内定植。

结果表明,YZ29能有效地在花生根际定居,为花生的生长促进和生物防治奠定了基础。关键词:铁载体产生菌;伊利诺伊芽孢杆菌;花生;定植;中国分类号S565.2文件识别号A文章编号1001-4942(2017)11-0064-05;二氧化硅产生菌的定植能力;花生根际的伊氏拟杆菌YZ29;李玉飞1、王梅2、邓海1、冰海1、王成强1,姚良通1,丁燕琴1(1.山东农业大学生命科学学院微生物学系,泰安271108;泰安市农业局271000人用荧光蛋白(GFP)提取标记微生物是研究微生物与宿主相互作用的重要手段。

本研究将穿梭载体pgp4412通过电穿孔法导入铁载体产生菌paenibacillus illinisensis YZ29中,获得成功表达绿色荧光蛋白的YZ29绿色荧光蛋白菌株。结果表明,YZ29在488nm激发波长的蓝光下,在花生根表面和SOI中均能观察到绿色荧光。YZ29-GFP在盆栽条件下可在花生根际和非根际土壤中定植。研磨培养,可定植于花生根系表面,不定植于根系。表明YZ29能有效地在花生根际定居,为花生的生长促进和生物防治效果奠定了基础。

关键词:产铁杆菌;拟杆菌;定殖铁载体是一种低铁环境中生长的微生物合成的低分子量铁螯合剂1,具有较高的Fe3+特异性。其螯合铁在铁胁迫下可直接作为植物的铁源,通过抑制病原微生物的生长,提高植物根系的抗病性。强调意义3-5。花生黄变病主要是由于花生生长发育过程中铁、硼、锌等微量元素供给不足,抑制了叶绿素的合成,影响了花生的光合作用,出现黄化症状6。应用铁载体产生菌能有效缓解作物缺铁引起的黄病,促进植物生长,提高产量。

纠正植物缺铁性黄病是一种安全、有效、经济的潜在途径。国内外相关研究人员在这方面做了大量的工作,如霍特等。7报道了产黄青霉铁载体的混合物可以提高碱性土壤中黄瓜和玉米的叶绿素含量;Masalha等。8研究表明,铁载体的螯合物和微生物铁离子在铁胁迫下可直接作为植物的铁源,从而提高黄瓜和玉米的铁含量。植物缺铁变黄的症状。植物根系或根际土壤中的有效定植是根际促生长菌发挥促生长作用的重要前提之一,因此,对其定植能力的研究已成为当前植物根系或根际土壤中促生长菌生防机理研究的重要组成部分。

绿色荧光蛋白(GFP)是一种很好的标记物,可以直接、准确地观察植物根系中促生长细菌的作用。广泛用于微生物标记。以9株枯草芽孢杆菌PTS-394为例,用绿色荧光蛋白标记,研究了其在番茄根系中的定殖能力;10株郝炳清为例,用绿色荧光蛋白标记。B96-II在黄瓜根际土壤中具有持久的定植能力,定植次数随土壤深度的增加而增加。本实验室从花生根际土壤中分离到伊利诺伊州芽孢杆菌YZ29。以往的研究表明,在盆栽条件下,伊利诺伊州芽孢杆菌YZ29能有效改善花生生长期的铁营养状况,增强花生根系活力,促进花生植株氮、磷、钾的积累,从而减轻缺铁性黄变,促进花生植株的生长发育。

花生生长。长期以来,田间试验也有很好的促进生长和增产效果11。为了进一步阐明YZ29菌株的促生长机理,采用绿色荧光蛋白GFP标记,并通过双抗体平板筛选和荧光显微镜观察初步研究了YZ29菌株在花生根中的定殖作用。材料与方法在实验室保存了伊利诺伊州芽孢杆菌YZ29的菌株和质粒,中国农业大学提出了芽孢杆菌和大肠杆菌的穿梭载体PGFP4412。植物材料花生品种小白沙(铁敏感品种)。_抗生素大观霉素(spe),工作浓度50ug/ml,YZ29耐药;卡那霉素(km),工作浓度50ug/ml,质粒耐药。

主要仪器BX51荧光显微镜,奥林巴斯光学;Eppnordf离心机5810离心机,埃彭多夫;BD-370LT超低温冰箱,青岛海尔股份有限公司;DNP9162电热孵化器,上海景洪实验设备有限公司;Geldoc IT凝胶成像系统,美国UVP公司;UV-2000型紫外线阀t可见分光光度计,Unico(上图)。海)仪器有限公司5810R离心机(冷藏),德国埃彭多夫公司。_ 1.2试验方法1.2.1灵敏度制剂YZ29单菌落在50m l-lb液体培养基中,37℃和180r/m in摇瓶培养14-16h,将5ml细菌溶液加入50ml新鲜培养基M(lb+0.5mol/l山梨醇)中,37℃和180r/min摇台培养,培养时间约5-6小时,培养时间为然后停止,直到OD600约为0.9。

在冰上放置10分钟,然后在4℃和6 000 r/min下离心5分钟以收集细菌。用溶液A(0.5摩尔/升山梨醇+0.5摩尔/升海藻糖+0.5摩尔/升甘露醇+10%甘油+去离子水)洗涤细菌4次。将菌株用1.2毫升溶液A(即合格菌株)重新悬浮,装入小的EP管中,每管含60毫升细菌溶液,置于-80℃下,将60μL的-1.2.2 EP管置于冰上,加入7μL提取的质粒溶液混合,冰浴5分钟。将上述混合物转移到0.1 cm的预冷电击杯中,电压为2.2 kv,电击时间为4.5-5.5 ms。

通过添加800μl溶液B(0.5 mol/l山梨醇+0.5 mol/l海藻糖+0.38 mol/l甘露醇+l b液体)洗脱细菌,并在37 C下培养3小时。用50 ug/ml的卡那霉素抗性平板包被,37℃培养2天,筛选单个菌落。用荧光显微镜观察荧光现象。用1.2.3质粒检测单菌落和YZ29单菌落8 h~OD600。用Omega EZNA质粒Mini试剂盒1试剂盒提取质粒,电压为120 V凝胶电泳40 min,提取质粒,检测质粒是否成功转移到荧光表达株中。

_ 1.2.4质粒稳定性检测标志物成功菌YZ29 gfp分别接种于含卡那霉素(50 ug/ml)和不含卡那霉素的10 ml液体LB培养基中,37℃培养,180 r/min培养,每12小时转移一次。将2%接种物分别转移到含卡那霉素(50ug/ml)和不含卡那霉素的液体培养基中,摇床培养12次。每隔36小时,将细菌溶液板稀释并涂抹在非抗性LB板上。培养后,在含有50 ug/ml卡那霉素抗性的LB平板上选择100个单菌落。

培养后,通过计算荧光条件下的菌落数来计算菌株的稳定性。质粒稳定性=可生长的发光菌落数/100。1.2.5 YZ29-GFP在不同培养条件下在花生根中的定植盆栽试验:用10%H_2o_2对花生种子进行消毒和黑暗浸泡30分钟,用水冲洗几次,种植在济南平阴县石灰土中,每盆5粒,出苗后固定苗,每盆2株。实验中设置了两种处理方法:1。每株花生植株分别用YZ29-GFP混悬液处理,5 ml浓度为108 cfu/ml,2。

每株花生用5毫升无菌水处理。分别于接种后10、20、30、50天检测根际土壤和非根际土壤中细菌的定殖。处理1用10 g根际土和10 g非根际土处理,梯度稀释,37℃下在含50 ug/ml大观霉素和卡那霉素的双抗体板上喷洒200 ug l,48小时,根据荧光显微镜发出的菌落形态和荧光信号进行细菌鉴定和计数。复制。接种后10、20、30、50天,用荧光显微镜观察荧光标记菌在根表面的定植情况。将花生的根取出,用无菌水冲洗。

用荧光显微镜观察其发光情况。2。对实验室培养的花生种子进行消毒,用10%过氧化氢浸泡30分钟,然后用水冲洗几次,在25℃下萌发48小时,然后移入50ml半固态霍格兰培养基的锥形瓶中,在28℃下培养,发芽后,用两种糖浆处理花生幼苗。建议:1.每株苗木用108cfu/ml的YZ29 gfp细菌溶液处理,2株苗木用同样量的无菌水处理。接种后3、7、10、15天取出幼苗,用无菌水冲洗附着在根部的琼脂。用手切琼脂,荧光显微镜观察。

_ 2结果与分析.1电转化后转化剂yz29-gfp_的荧光显微镜检查,菌落形态与原细菌相似,但微黄绿色,gfp可成功导入yz29并成功表达转化剂yz29-gfp。当YZ29玻璃钢片置于荧光显微镜下时,变压器显示荧光(图1a)。为了进一步确认转化体,选择单个菌落,分散于无菌水中制成玻片。在488nm处用蓝光在100倍激发波长下观察到亮绿色荧光(图1b),表明质粒成功转移到YZ29并成功表达绿色荧光。筛选质粒2.2后,成功表达质粒yz29-gfp和yz29。

用凝胶电泳检测质粒是否成功转移到YZ29中。如图2所示,质粒大小约为10.7kb时,质粒提取质量较好,进一步证实了质粒成功转移到表达荧光的YZ29菌株中。_ 2.3质粒遗传稳定性_标记株YZ29-GFP的质粒稳定性试验结果表明,标记株的稳定性随转染次数的增加而降低,无选择性压力。在培养基中不加卡那霉素的情况下,YZ29-GFP菌株连续三次转染,质粒的稳定性为77%,质粒的稳定性为零6次。在培养基中加入卡那霉素后,YZ29-GFP菌株连续12次转移,质粒的稳定性为82%。

能满足定殖试验的要求。_利用荧光显微镜观察了YZ29-GFP菌株在花生盆栽中的定殖,以及YZ29-GFP菌株在花生根系表面的定殖。用双抗性平板对花生根际土壤和非根际土壤中YZ29-GFP菌株的计数结果(图3)表明,YZ29-GFP在根际土壤和非根际土壤中的定殖趋势基本相同,根际土壤和非根际土壤的定殖数量也基本相同。油大于非根际土壤,细菌在根际土壤中的定殖能力强于非根际土壤.5在实验室条件下YZ29-GFP菌株在花生根际的定殖用荧光显微镜观察花生幼苗在半固体霍格兰培养基上的定殖。

使用YZ29 GFP后3天、7天、10天和15天。随着使用时间的延长,细菌数量逐渐减少,15天内无细菌存在。如图所示。4a、4b、yz29-gfp仅在7天时在根系表面存在,但在根系内部未发现真菌。15天时,根的表面和内部均未发现真菌,如图所示。4c和4d。可见YZ29 gfp只能在花生根系表面定植,不能在花生体内定植内生细菌。_关于伊利诺伊州芽孢杆菌的讨论和结论目前很少有报道。据报道,伊利诺伊州芽孢杆菌KJA-424能产生几丁质酶降解几丁质酶,对辣椒疫霉13有防治作用。

伊利诺伊州芽孢杆菌ST-12K菌株可产生环糊精-葡聚糖转移酶14。我们的实验室报告说,伊利诺伊芽孢杆菌能产生环糊精-葡聚糖转移酶14。植物生长促进作用11。影响促生长细菌定植的因素很多,如细菌特性、植物分泌物、土壤特性等12。在成膜前用无菌水冲洗根系也会影响观察结果。研究表明,YZ29在根际土壤和非根际土壤中均存在,是根际细菌而不是内生细菌,可能在花生根系发育和物质运输中起到一定作用。结果表明,YZ29菌株能有效地在根际定植,适合于生物肥料菌株。

然而,伊利诺伊芽孢杆菌在花生根际的定植,需要进一步研究其防治花生缺铁黄原病的机理。1买方:J S,Kratzke M G,Sikora L J.A.大麦根际中由促进植物生长的假单胞菌菌株产生的磷铁素(pseubactin)检测方法,应用与环境微生物学,1993,59(3)677-681.2klepper J,Leong J,Teintze M,Al.通过促进植物生长的根杆菌促进铁载体的生长促进植物生长J.Nature,1980,286(5776)885-886.Couillerot O、Prigent Combaret C、Caballero Mellado J等。

荧光假单胞菌及其密切相关的荧光假单胞菌作为土壤植物病原菌的生物防治剂J.应用生物学报,2009,48(5)505-512.4林天星、唐梅、黄明远等。高产铁载体棉田土壤细菌SS05的筛选与鉴定J.微生物学通报,2012,39(5)668-676.5 Sayed R Z,Chincholkar S.B.Siderophore生产基因校准比化学功能更具生物控制潜力J.当代微生物学科学,山西农业科学,2006(5)97-98.7Hordt W、Romhold、Winkelmann G.Fusarines和二聚体酸、产自黄青霉的单羟肟酸和二羟肟酸、铁利用策略和I str.Ategy II植物j。

《生物医学》,2000年,1337-1336年。8Masalha J、Kosegarten H、Elmaci等。微生物活性在玉米和向日葵中获取铁的中心作用。土壤生物学与肥力,2000,30(5/6)433-439。刘有洲,梁学杰,乔俊清等.绿色荧光蛋白标记及其对枯草芽孢杆菌PTS-394繁殖能力的测定.植物保护杂志,2014,41(4)416-422.《植物根际土壤有益细菌竞争定植的影响因素》,生物科学、生物技术和生物化学,2010,29(6)1235-1239。

13 Doukyu N,Kuwahara H,Aono R.产生耐有机溶剂环糊精-胰高血糖素转移酶的拟杆菌的分离.生物科学,生物化学,2003,67(2)334-340.14 Jung W J,J in Y L,Park R D,AT Al.拟杆菌感染抑制辣椒根抗氧化酶活性的研究,世界微生物学与生物技术杂志,2006,22901-907。山东农业科学2017,49(11)69-73,81山东农业科学S山东农业科学49卷11号,杨正涛等。

生物床垫材料和土壤改良剂在猪场中的应用效果研究DII1014083/J.ISSN.1001-942.2017.11013;接收日期2017~0824;基础工程山东重点研究和发展计划(2015GSF11700);济南鲤城区科学技术发展计划(2017);寿光C杨正涛,男,山东烟台人,硕士,环境科学与工程专业。电子邮箱:804212947@qq.com通讯作者张长爱(1971-),男,山东省泰安市人,博士,副研究员,主修农业资源与环境研究。

邮箱zca 2006@sina.com。。